膜蛋白這類難制備的抗原,抗體定制需特別注意哪些環節?
日期:2025-12-10 13:20:51
膜蛋白這類難制備的抗原進行抗體定制,需重點關注抗原設計、表達體系、免疫策略及后續驗證等特殊環節,具體如下:
1、抗原的精準設計與選擇
2、合適的抗原表達體系
4、針對性的抗體驗證環節
1、抗原的精準設計與選擇
膜蛋白存在跨膜疏水區,直接制備全長蛋白難度大且易失活,需優先選擇胞外區/胞內區的親水片段作為抗原,避開跨膜結構域;若需靶向膜蛋白構象表位,可設計包含部分跨膜區的短肽或融合蛋白,同時保留天然構象關鍵位點。
可通過生物信息學分析預測抗原的免疫原性、親疏水性,對低免疫原性片段進行KLH、BSA等載體蛋白偶聯,提升免疫原性。
2、合適的抗原表達體系
避免使用常規原核表達體系(易導致膜蛋白無活性、錯誤折疊),優先選擇真核表達體系(如CHO細胞、HEK293細胞、昆蟲細胞),這類體系可實現蛋白的正確折疊、糖基化修飾及膜定位,更接近天然狀態;也可采用無細胞表達體系,減少膜蛋白在宿主細胞中的毒性積累。
對于多跨膜蛋白,可通過融合標簽(如His、Flag)輔助蛋白純化,同時優化表達條件(如誘導溫度、時間),提高可溶性蛋白的產量。

3、個性化免疫方案
因膜蛋白抗原免疫原性可能較弱,需選擇高免疫活性的實驗動物(如兔、羊,或針對特殊表位的小鼠),并采用“基礎免疫+多次加強免疫”的方案,延長免疫周期,必要時添加專用佐劑(如弗氏佐劑、脂質體佐劑)增強免疫應答。
若制備單克隆抗體,需在雜交瘤篩選階段,提前設置天然膜蛋白結合驗證的篩選條件,避免僅識別變性抗原的抗體被篩選出來。
4、針對性的抗體驗證環節
除常規的ELISA效價檢測外,需增加天然狀態下的結合驗證,如采用流式細胞術(檢測細胞膜表面抗原)、免疫熒光(驗證細胞內定位)、Co-IP(驗證蛋白互作)等方法,確認抗體能識別天然構象的膜蛋白。
若抗體用于功能研究,還需補充功能阻斷實驗,驗證抗體對膜蛋白生物學功能(如信號傳導、受體結合)的影響。
5、抗原的穩定性與儲存保障
膜蛋白易降解、聚集,制備過程中需全程控制溫度(低溫操作),使用專用的膜蛋白緩沖液(含去污劑、穩定劑)維持其構象穩定;交付的抗原需明確儲存條件(如-80℃分裝保存,避免反復凍融),減少活性損失。






