單克隆抗體制備過(guò)程，若免疫后動(dòng)物未產(chǎn)生有效抗體，可能的原因（如抗原免疫原性弱、免疫方案不當(dāng)）有哪些，該如何調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案？
日期：2025-09-28 09:22:59
在單克隆抗體制備中，免疫后動(dòng)物未產(chǎn)生有效抗體（通常以血清效價(jià)低或無(wú)特異性結(jié)合為判斷標(biāo)準(zhǔn)）是常見(jiàn)問(wèn)題，核心原因可歸結(jié)為抗原本身特性、免疫方案設(shè)計(jì)、動(dòng)物個(gè)體差異三大類(lèi)，需針對(duì)性分析并調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案。
一、核心原因分析
1.抗原相關(guān)因素（最主要原因）
抗原的免疫原性直接決定動(dòng)物免疫系統(tǒng)能否被有效激活，是產(chǎn)生抗體的基礎(chǔ)。
（1）免疫原性極弱：
小分子抗原（如分子量＜1kDa的多肽、激素、藥物）、高度保守的自身抗原（如人體同源性＞95%的蛋白）或結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的抗原（如單糖、脂類(lèi)），因缺乏足夠的“異物信號(hào)”和免疫識(shí)別表位，難以被動(dòng)物B細(xì)胞識(shí)別和呈遞。
例如：純化的人源白蛋白免疫小鼠時(shí)，因小鼠與人類(lèi)白蛋白同源性高，常難以產(chǎn)生高滴度抗體。
（2）抗原純度不足或結(jié)構(gòu)破壞：
抗原中混有大量雜蛋白（如原核表達(dá)的包涵體未徹底純化）、內(nèi)毒素或降解片段，會(huì)分散免疫系統(tǒng)的應(yīng)答焦點(diǎn)，導(dǎo)致針對(duì)目標(biāo)抗原的特異性抗體減少；若抗原在純化/儲(chǔ)存中發(fā)生變性（如高溫、反復(fù)凍融破壞空間構(gòu)象），則其天然表位消失，無(wú)法誘導(dǎo)特異性免疫。
（3）抗原劑量失衡：
劑量過(guò)低時(shí)，不足以激活免疫系統(tǒng)；劑量過(guò)高（尤其是可溶性抗原）可能誘導(dǎo)免疫耐受——免疫系統(tǒng)將高濃度抗原識(shí)別為“自身成分”，反而抑制B細(xì)胞活化（如過(guò)量的重組細(xì)胞因子免疫動(dòng)物）。
2.免疫方案設(shè)計(jì)缺陷
即使抗原免疫原性尚可，不合理的免疫流程也會(huì)導(dǎo)致應(yīng)答失敗。
（1）免疫途徑不當(dāng)：
不同途徑的抗原遞呈效率差異極大。例如，僅采用腹腔注射可溶性抗原時(shí)，抗原易被快速清除，難以有效激活樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和T細(xì)胞；而皮內(nèi)注射（含佐劑）可通過(guò)刺激局部淋巴結(jié)，顯著提升免疫應(yīng)答。
（2）佐劑選擇或使用錯(cuò)誤：
佐劑的核心作用是延長(zhǎng)抗原滯留時(shí)間、激活固有免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞），增強(qiáng)抗原免疫原性。若未使用佐劑（尤其針對(duì)可溶性抗原）、佐劑種類(lèi)不當(dāng)（如用弗氏不完全佐劑做首次免疫，缺乏免疫激活成分），或佐劑與抗原混合不均（如乳化不徹底，抗原快速釋放），都會(huì)導(dǎo)致免疫應(yīng)答微弱。
（3）免疫間隔與次數(shù)不合理：
免疫間隔過(guò)短（如＜7天），動(dòng)物免疫系統(tǒng)尚未完成B細(xì)胞增殖分化，無(wú)法產(chǎn)生有效記憶細(xì)胞；間隔過(guò)長(zhǎng)（如＞30天），初次免疫的記憶細(xì)胞衰減，難以疊加應(yīng)答；免疫次數(shù)不足（如僅1-2次），則無(wú)法達(dá)到抗體效價(jià)峰值。
（4）抗原與佐劑比例失衡：
抗原過(guò)多而佐劑不足，無(wú)法有效“包裹”抗原；佐劑過(guò)多而抗原不足，可能引發(fā)過(guò)度炎癥反應(yīng)，反而抑制特異性免疫。
3.動(dòng)物個(gè)體與生理狀態(tài)影響
（1）品系不匹配：
不同近交系小鼠的MHC（主要組織相容性復(fù)合體）基因型不同，對(duì)同一抗原的識(shí)別能力差異極大。例如，C57BL/6小鼠對(duì)某些病毒抗原應(yīng)答強(qiáng)，而B(niǎo)ALB/c小鼠對(duì)細(xì)菌抗原應(yīng)答更優(yōu)，選錯(cuò)品系可能導(dǎo)致無(wú)應(yīng)答。
（2）年齡與健康狀態(tài)：
幼年動(dòng)物（＜6周齡）免疫系統(tǒng)未成熟，老年動(dòng)物（＞8月齡）免疫功能衰退，均難以產(chǎn)生強(qiáng)應(yīng)答；動(dòng)物若感染病原體（如小鼠肝炎病毒）、存在免疫缺陷（如SCID小鼠）或應(yīng)激狀態(tài)（如飼養(yǎng)環(huán)境惡劣），也會(huì)抑制免疫反應(yīng)。
（3）性別差異：
雌性動(dòng)物（尤其是未孕狀態(tài)）的體液免疫應(yīng)答通常強(qiáng)于雄性，部分抗原（如性激素相關(guān)抗原）可能因性別差異導(dǎo)致應(yīng)答不同。
二、實(shí)驗(yàn)方案調(diào)整策略
1.針對(duì)“抗原問(wèn)題”的核心調(diào)整
（1）增強(qiáng)抗原免疫原性（最關(guān)鍵）：
小分子/弱免疫原性抗原：采用“載體偶聯(lián)法”，將抗原與強(qiáng)免疫原性載體（如KLH、BSA、OVA）交聯(lián)（通過(guò)EDC、戊二醛等交聯(lián)劑），利用載體的表位激活T細(xì)胞，間接輔助B細(xì)胞活化。例如，多肽抗原需優(yōu)先偶聯(lián)KLH后再免疫。
自身抗原：①選擇與目標(biāo)物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的動(dòng)物（如人源抗原免疫大鼠而非小鼠）；②對(duì)自身抗原進(jìn)行修飾（如磷酸化、甲基化）或截取非保守片段，打破免疫耐受；③采用“異種同源抗原聯(lián)合免疫”（如人+猴同源抗原混合免疫）。
變性抗原：重新制備/純化抗原，確保其天然構(gòu)象（如采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)替代原核系統(tǒng)，避免包涵體變性；儲(chǔ)存時(shí)采用-80℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融）。
（2）優(yōu)化抗原純度與劑量：
純度：通過(guò)層析（如Ni柱、凝膠過(guò)濾）、電泳純化等方法，將抗原純度提升至＞90%，去除雜蛋白和內(nèi)毒素（內(nèi)毒素含量需＜0.1EU/μg）。
劑量：根據(jù)抗原類(lèi)型調(diào)整，可溶性抗原通常首次免疫劑量為50-100μg/只（小鼠），加強(qiáng)免疫為25-50μg/只；顆粒性抗原（如病毒、細(xì)胞）劑量可減半（25-50μg/只），避免免疫耐受。
2.針對(duì)“免疫方案”的系統(tǒng)優(yōu)化
（1）調(diào)整免疫途徑：
優(yōu)先選擇“皮內(nèi)多點(diǎn)注射”（背部或腹部，4-6點(diǎn)）或“淋巴結(jié)周?chē)⑸?rdquo;（如小鼠腋窩、腹股溝淋巴結(jié)附近），利用局部淋巴結(jié)的抗原遞呈優(yōu)勢(shì)；首次免疫可結(jié)合“腹腔注射”，加強(qiáng)免疫采用“皮下+腹腔聯(lián)合注射”，提升應(yīng)答效率。
（2）優(yōu)化佐劑選擇與使用：
首次免疫：必須使用弗氏完全佐劑（CFA），其含分枝桿菌成分，可強(qiáng)效激活巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞；加強(qiáng)免疫改用弗氏不完全佐劑（IFA），避免CFA的過(guò)度炎癥反應(yīng)。
替代佐劑：若對(duì)CFA的刺激性敏感，可選用鋁佐劑（適用于蛋白抗原）、ISCOM（免疫刺激復(fù)合物，適用于膜蛋白）或商品化佐劑（如Sigma的MPL+TDM佐劑），需提前預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證效果。
乳化要求：抗原與佐劑按1:1體積比混合，采用雙注射器反復(fù)推注至“水滴法不擴(kuò)散”（滴入水中呈球形不分散），確?？乖徛尫?。
（3）修正免疫間隔與次數(shù)：
標(biāo)準(zhǔn)流程：首次免疫后，間隔14天進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，再間隔14天進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫；加強(qiáng)免疫后7-10天采血檢測(cè)血清效價(jià)，若效價(jià)低，可追加1次加強(qiáng)免疫（間隔7天），避免過(guò)度免疫。
3.針對(duì)“動(dòng)物因素”的調(diào)整
（1）更換動(dòng)物品系：
若原品系（如BALB/c）無(wú)應(yīng)答，可換用免疫應(yīng)答更強(qiáng)的品系（如C57BL/6、ICR小鼠，或大鼠），優(yōu)先選擇近交系動(dòng)物（遺傳背景均一，應(yīng)答穩(wěn)定）。
（2）選擇適齡健康動(dòng)物：
選用6-8周齡、體重18-22g的雌性小鼠（體液免疫應(yīng)答強(qiáng)），確保動(dòng)物無(wú)病原體感染（SPF級(jí)最佳），飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定（溫度22-25℃、濕度40%-60%，避免應(yīng)激）。
（3）預(yù)免疫篩選：
對(duì)同一批動(dòng)物先進(jìn)行“預(yù)免疫”（小劑量抗原+佐劑），14天后采血檢測(cè)血清效價(jià)，篩選出應(yīng)答陽(yáng)性的動(dòng)物進(jìn)行正式免疫，排除個(gè)體無(wú)應(yīng)答情況。
三、關(guān)鍵驗(yàn)證步驟
在調(diào)整方案后，需通過(guò)血清效價(jià)檢測(cè)（如ELISA）和特異性驗(yàn)證（如WB、IHC）確認(rèn)免疫效果：
若ELISA效價(jià)＞1:10000，且WB/IHC顯示特異性結(jié)合，說(shuō)明免疫成功；
若效價(jià)仍低但有特異性，可追加1次加強(qiáng)免疫；
若效價(jià)為0或無(wú)特異性，需重新排查抗原免疫原性（如更換載體偶聯(lián)方式）或徹底更換抗原/動(dòng)物品系。
免疫無(wú)應(yīng)答的核心是“抗原-免疫方案-動(dòng)物”的匹配問(wèn)題，需優(yōu)先排查抗原免疫原性，再系統(tǒng)優(yōu)化免疫流程，最終通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)和效價(jià)檢測(cè)確保免疫成功。
