盡管當前有多種方法可用于全面研究蛋白質編碼基因的細胞內作用，然而用于系統研究與多種生物學信號通路有關的長鏈非編碼RNAs (lncRNAs)的技術卻十分有限。在這篇文章中，來自德國德累斯頓工業大學的研究人員開發了一種結合非編碼RNAs敲除和定位分析的技術，稱之為c-KLAN。利用這一技術對lncRNAs進行了功能鑒定和定位，并鑒別出了調控小鼠胚胎干細胞類型的轉錄物。

在真核生物基因組中大量的蛋白質編碼和非編碼轉錄物被轉錄，然而直到近年來后者才獲得廣泛的科學關注。LncRNAs是一類非蛋白質編碼轉錄物，長度在幾百bp到幾kb之間。 眾所周知其參與了多種生物學過程，例如X-染色體失活、染色質水平的表觀遺傳學狀態調控、胚胎干細胞狀態維持、轉錄調控以及疾病狀態調控等。盡管利用標記和成像技術結合功能缺失研究已成功地應用于大量的蛋白質編碼基因研究中，卻還沒有關于長鏈非編碼轉錄物顯像和表型特征鑒定的類似方法被報道。核酸內切酶切割制備的短干擾RNAs （endoribonuclease?prepared short interfering RNAs，esiRNAs）已被證實更加適合于RNAi篩選，因為它們能夠有效地敲除靶向轉錄物，又避免了天然復雜的siRNAs的顯著脫靶效應。研究人員認為相同的優勢同樣適用于沉默lncRNAs。

在這篇文章中，研究人員構建了一個能靶向594種lncRNAs的esiRNA文庫，在小鼠細胞中進行了功能缺失篩查。同時，研究人員還改良了esiRNA合成方法，實現了無縫、可再生合成特異性探針檢測了細胞中lncRNAs的定位。

IncRNAs的esiRNAs和RNA FISH探針的合成路線

步驟：對lncRNA序列進行DEQOR優化和經由電腦模擬設計引物，隨后對cDNA進行PCR擴增，完成對PCR擴增產物的測序和定量檢測。接下來一方面通過體外轉錄PCR擴增產物生成dsRNA，然后利用Rnse III酶切就生成了可用于IncRNAs功能缺失研究的esiRNA文庫。另一方面可利用鏈特異性RNA聚合酶和熒光標記UTPs對PCR進行體外轉錄，即可生成正義或反義探針。然而采用FISH技術對IncRNAs進行定位分析。

利用c-KLAN研究了Panct1在小鼠ESCs中的作用

研究人員利用c-KLAN揭示了小鼠胚胎干細胞中轉錄物Panct1的定位和功能。證實Panct1主要定位于細胞核中，其在ESC狀態維持中發揮著關鍵性的作用。

lncRNA生物學的快速發展需要對這些轉錄物進行深入的檢測，但由于轉錄組的復雜性和適當注解的局限性很難對這些轉錄物進行標記。在此項研究中，科研人員介紹了一種組合方法可大規模地對lncRNAs進行定位和功能分析。c-KLAN為我們提供了一種快速、簡便和可靠的途徑檢測lncRNA介導的各種細胞過程的調控。