美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院眼科研究所的一組研究人員報(bào)道了最新成果：他們通過一種病毒載體直接向眼睛輸送了基于CRISPR-as9的治療元件，成功在視網(wǎng)膜變性小鼠中阻止了視網(wǎng)膜色素變性。這一研究成果公布在3月14日的Nature Communications雜志上，文章的通訊作者是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院眼科研究所的吳志堅(jiān)研究員（Zhijian Wu，音譯）。

視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis pigmentosa）是一種具有明顯遺傳傾向的慢性、進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素上皮和光感受器的變性疾病，發(fā)病率大約為四千分之一，會(huì)引發(fā)視網(wǎng)膜變性，并最終導(dǎo)致失明。這種遺傳性疾病已與超過60個(gè)基因（和超過3,000個(gè)突變）相關(guān)聯(lián)，因此為基因治療增加了難度，最新這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，基于基因編輯的更廣泛治療方法可用于靶向視網(wǎng)膜色素變性中的多個(gè)遺傳缺陷。

在視網(wǎng)膜的眼后部組織中有兩種類型的細(xì)胞，能將光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)發(fā)給大腦，視桿光感受器能在昏暗的光線下產(chǎn)生視覺，而視錐光感受器則能在光照條件下實(shí)現(xiàn)色彩視覺和觀察。遺傳突變主要影響前者，導(dǎo)致夜盲癥，就像是視網(wǎng)膜色素變性患者看到的那樣。不過由于視桿光感受器也會(huì)為視錐光感受器提供重要的結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)支持，因此視桿光感受器障礙或死亡會(huì)導(dǎo)致視錐光感受器變性和失明。

為此眼科研究所眼部基因治療中心主任吳志堅(jiān)等人設(shè)計(jì)了一種CRISPR單導(dǎo)向RNA（sgRNA），靶向視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄因子：神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈（Neural retina leucine zipper，Nrl），Nrl能調(diào)控視網(wǎng)膜發(fā)育過程中特殊視桿細(xì)胞的命運(yùn)，并維持成熟視網(wǎng)膜內(nèi)的視桿細(xì)胞。研究小組將Nrl-sgRNA和Cas9內(nèi)切核酸酶通過兩個(gè)單獨(dú)的腺相關(guān)病毒（AAV）載體，直接遞送到小鼠視網(wǎng)膜上。他們指出，這種AAV載體的優(yōu)點(diǎn)就是能維持非分裂細(xì)胞（例如視網(wǎng)膜細(xì)胞）中長(zhǎng)期基因表達(dá)的能力。

來自華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的神經(jīng)病理學(xué)家Joseph Corbo（未參與該項(xiàng)研究）表示，“目前缺乏針對(duì)視網(wǎng)膜變性的有效治療，特別是缺乏這種疾病不同遺傳變異的治療，這項(xiàng)研究是我們領(lǐng)域中非常令人激動(dòng)的一項(xiàng)重要進(jìn)步”。Corbo實(shí)驗(yàn)室是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)靶向Nrl可以保留小鼠視錐細(xì)胞功能的實(shí)驗(yàn)室。

在最新研究中，研究人員利用基于Cre的重組系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)敲除Nrl可以將視桿細(xì)胞部分轉(zhuǎn)換類似視錐細(xì)胞，防止視桿細(xì)胞的死亡以及視網(wǎng)膜色素變性中二級(jí)視錐細(xì)胞的死亡。

吳志堅(jiān)研究員表示，“我們的想法不是將視桿細(xì)胞轉(zhuǎn)變成真正的視錐細(xì)胞，而是令它們獲得一些視錐細(xì)胞的特征，從而能低空引發(fā)其最終死亡的突變影響。”

但Cre重組方法并不使用于人體，因此研究人員轉(zhuǎn)向了CRISPR系統(tǒng)。 “這項(xiàng)新工作獲得了兩個(gè)方面的進(jìn)步：作者采用了了一種AAV介導(dǎo)的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)，可以應(yīng)用于人類患者，并且他們指出了這種策略可以在多種視網(wǎng)膜變性模型中起作用。”

研究組首先將實(shí)驗(yàn)治療載體注射到2周齡野生型小鼠的視網(wǎng)膜中，然后觀察小鼠在三至四個(gè)月內(nèi)的變化。與注射對(duì)照載體的小鼠相比，接受治療的小鼠Nr1表達(dá)量降低。在注射后第6周，治療小鼠視桿細(xì)胞出現(xiàn)了下調(diào)的視桿細(xì)胞基因，以及上調(diào)的視錐細(xì)胞基因。同時(shí)研究人員也指出，這種治療不會(huì)對(duì)視錐細(xì)胞產(chǎn)生任何有害作用。

這種完整消除Nrl的效果令人印象深刻，也是這項(xiàng)工作的一個(gè)關(guān)鍵成果。

然后，研究組在三種不同的視網(wǎng)膜色素變性小鼠模型上檢測(cè)了載體，其中包括視紫紅質(zhì)基因中表達(dá)顯性人類突變的模型，之后再觀察幾個(gè)月后小鼠的變化，結(jié)果表明在所有三種情況下，治療小鼠保留了更多的視桿細(xì)胞，阻止了視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的死亡。

去年年初，美國(guó)Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心的研究人員利用CRISPR-Cas9刪除視網(wǎng)膜色素變性的遺傳突變，他們將這個(gè)系統(tǒng)注入年輕的實(shí)驗(yàn)室大鼠體內(nèi)，這種大鼠已被改造成模擬一種遺傳性視網(wǎng)膜色素變性，稱為常染色體顯性遺傳，這涉及到該基因的突變。單次注射后，通過視動(dòng)反射測(cè)量——包括轉(zhuǎn)動(dòng)頭部響應(yīng)運(yùn)動(dòng)不同亮度的條紋，研究人員發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組動(dòng)物相比，這些大鼠的視力變得更好。華人女學(xué)者用CRISPR技術(shù)改善遺傳性失明之后，哥倫比亞大學(xué)醫(yī)學(xué)中心（CUMC）等處的Stephen Tsang等人也利用一種基于CRISPR的方法來修復(fù)人類和小鼠視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)的突變，而他們利用的是視網(wǎng)膜色素變性患者的皮膚樣品制備干細(xì)胞。由于病人來源的干細(xì)胞仍攜帶有致病基因突變，因此，該研究團(tuán)隊(duì)使用CRISPR來修復(fù)有缺陷的基因。干細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化為健康的視網(wǎng)膜細(xì)胞，并移植到同一患者中來治療視力喪失。研究人員靶定了視網(wǎng)膜色素變性最常見的一個(gè)變體，它是由RGPR基因中一個(gè)單一錯(cuò)誤引起的。RGPR的組成——其中包含許多重復(fù)和緊密結(jié)合的核苷酸對(duì)，使它成為一個(gè)很難編輯的基因。

對(duì)于最新成果，Tsang表示，“這種類型的‘不精確醫(yī)學(xué)方法’可能患有視網(wǎng)膜色素變性的任何患者的第一個(gè)應(yīng)用，因?yàn)橛?span lang="EN-US">67個(gè)基因。”

不過在人體進(jìn)行檢測(cè)之前，還需要回答幾個(gè)問題，比如Cas9的長(zhǎng)期表達(dá)是否對(duì)視網(wǎng)膜有害，以及Nrl的消除在人體中是否能有小鼠中相同的效果。

佛羅里達(dá)大學(xué)的Shannon Boye評(píng)論道，“還需要更多的研究來確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但這些研究對(duì)于分析CRISPR-Cas9在有絲分裂后神經(jīng)元中的作用方面令人鼓舞。”

“CRISPR技術(shù)與腺相關(guān)病毒載體的組合，這嘗試真正將遺傳信息遞送到視網(wǎng)膜上，也許代表了視桿細(xì)胞相關(guān)退行性疾病治療方面的第一步。”