1、龍牙草、五倍子和APRG64是否可以影響SARS-CoV-2的復(fù)制？

由于龍牙草、五倍子和APRG64具有治療多種疾病功效，因此作者們首先對(duì)龍牙草、五倍子和APRG64的SARS-CoV-2抗病毒活性進(jìn)行了分析。用龍牙草、五倍子、APRG64、瑞德西韋或磷酸氯喹預(yù)處理2小時(shí)后的Vero細(xì)胞感染SARSCoV-2。在感染后72小時(shí)（hpi），評(píng)估斑塊形成的減少。如Fig.1A所示，龍牙草、五倍子和APRG64均對(duì)斑塊形成有極大的抑制作用。另外，Yeong-Geun Lee等人分別在有或沒有AP、RG、APRG64、瑞德西韋或磷酸氯喹的情況下處理已感染SARS-CoV-2的Vero細(xì)胞，1小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞3次來(lái)去除未附著的病毒和細(xì)胞培養(yǎng)基中的提取物，并評(píng)估斑塊形成的減少。如Fig.1B所示，龍牙草、五倍子和APRG64對(duì)SARS-CoV-2的復(fù)制有強(qiáng)烈的抑制作用。值得注意的是，與龍牙草、五倍子和APRG64，瑞德西韋和氯喹沒有顯示出顯著的抗病毒活性。這些結(jié)果表明龍牙草、五倍子和APRG64通過與瑞德西韋和磷酸氯喹不同的抗病毒機(jī)制干擾病毒進(jìn)入，從而對(duì) SARS-CoV-2表現(xiàn)出高效的抗病毒活性。

Fig. 1. Anti-SARS-CoV-2 activity of Agrimonia pilosa (AP), Galla rhois (RG), and their mixture (APRG64)

前面已經(jīng)提到，APRG64是龍牙草、五倍子的混合物，由于其在體外和體內(nèi)的安全性已在他們之前的研究中得到證實(shí)，因此在以下實(shí)驗(yàn)中對(duì)其活性成分進(jìn)行了研究。

2、APRG64中抗SARS-CoV-2的活性成分是什么？

為了研究APRG64中抗SARS-CoV-2的活性成分，他們反復(fù)在這些植物中提取并分離出多種成分，包括熊果酸(1)、沒食子酸乙酯(11)和1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖(12)。根據(jù)APRG64的LC/MS分析結(jié)果，選擇了一種三萜類化合物(1)、一種香豆素(2)、八種黃酮類化合物(3-10)和兩種沒食子酸酯衍生物(11和12)作為APRG64的活性成分和潛在的抗COVID-19成分（Fig. 2）。

Fig. 2. Chemical structures of isolated constituents from mixture of Agrimonia pilosa (AP) leaves and Galla rhois (RG) fruits in 50% EtOH extract (APRG64)

分理出這些活性成分后，作者們進(jìn)一步探索了這些次級(jí)代謝物對(duì)SARS-CoV-2復(fù)制的抑制作用。感染SARS-CoV-2后的Vero細(xì)胞用化合物1-12、瑞德西韋或磷酸氯喹處理，1小時(shí)后，洗滌細(xì)胞以去除未附著的病毒顆粒和化合物。在72 hpi時(shí)，使用噬菌斑分析計(jì)算噬菌斑的數(shù)量。如Fig. 3A所示，三種濃度（1、5和25 µg/mL）的熊果酸(1)、槲皮素(7)、沒食子酸乙酯(11)和1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖(12)均顯著抑制斑塊形成。與另外三種成分相比，沒食子酸乙酯(11)的抑制效果較弱（減少率：25μg/mL時(shí)為21.05%）。這個(gè)結(jié)果在分析細(xì)胞上清液中的SARS-CoV-2刺突蛋白時(shí)得到了驗(yàn)證（Fig. 3B）。熊果酸(1)、槲皮素(7)和 1,2,3,4,6-penta-O-galloylβ-D-葡萄糖(12)顯著減少了細(xì)胞上清液中SARS-CoV-2刺突蛋白的數(shù)量。

此外，他們還用熊果酸(1)、槲皮素(7)和1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖(12)進(jìn)行后處理，看它們是否能夠抑制SARS-CoV-2復(fù)制。如Fig. 3C所示，樣品經(jīng)這三種成分后處理后，上清中的SARS-CoV-2刺突蛋白顯著減少。

Fig. 3. Antiviral activity of active components isolated from APRG64 against SARS-CoV-2. Vero cells were seeded 1 day before infection

這些結(jié)果表明APRG64的活性成分（熊果酸(1)、槲皮素(7) 和1,2,3,4,6-penta-Ogalloyl-β-D-葡萄糖(12)）通過干擾病毒吸收和吸收后階段來(lái)抑制SARS-CoV-2復(fù)制。

3、APRG64的活性成分能阻礙病毒RBD與宿主細(xì)胞的結(jié)合嗎？

眾所周知，病毒刺突RBD和宿主細(xì)胞上ACE2蛋白的結(jié)合是SARS-CoV-2進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。由于APRG64及其成分被證明會(huì)干擾病毒吸收，所以作者猜想APRG64成分可能會(huì)阻礙病毒刺突RBD與宿主細(xì)胞的結(jié)合。

為了驗(yàn)證這一猜想，將病毒刺突RBD與APRG64的三種主要抗病毒成分（熊果酸(1)、槲皮素(7)和1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接分析。由于SARS-CoV-2的S棘突蛋白R(shí)BD會(huì)不斷發(fā)生突變，所以，作者在這里分別分析了APRG64組分與SARS-CoV-2棘突RBD及其變體B.1.1.7棘突RBD的結(jié)合親和力。

首先，作者通過全局模型質(zhì)量估計(jì)(GMQE)和定性模型能量分析(QMEAN)生成并驗(yàn)證B.1.1.7突變株的RBD結(jié)構(gòu)模型。然后，比較SARS-CoV-2 RBD和B.1.1.7突變株RBD與熊果酸 (1)、槲皮素(7)和1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖的分子對(duì)接分析來(lái)評(píng)估APRG64活性成分的潛在抗病毒作用（Table 1）。

Table 1. Binding energy calculated from molecular docking analysis of SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain (RBD) and B.1.1.7 lineage spike RBD with three antiSARS-CoV-2 compounds of APRG64, ursolic acid (1), quercetin (7), and 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose (12)

Table 1中的數(shù)據(jù)顯示，與其他化合物相比，熊果酸(1)對(duì) SARS-CoV-2 RBD和B.1.1.7突變株RBD顯示出最高的結(jié)合能（分別為- 9.5 kcal/mol 和- 9.0 kcal/mol）。此外，他們還通過Autodock預(yù)測(cè)了SARS-CoV-2刺突RBD和B.1.1.7突變株刺突RBD與熊果酸(1)、槲皮素(7)和1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖三種APRG64活性成分的分子結(jié)合。這些結(jié)果均可對(duì)APRG64具有抗SARS-CoV-2和B.1.1.7突變株的病毒作用形成強(qiáng)有力的支撐。

簡(jiǎn)言之，這項(xiàng)研究表明APRG64是治療SARS-CoV-2及其變體的有效候選藥物。但是APRG64是否會(huì)成為治療COVID-19的新型候選抗病毒藥物仍需進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。

這項(xiàng)研究的關(guān)鍵部分用到了華美生物提供的SARS-CoV-2 spike RBD Nanobody (CSB-RA33245A2GMY)檢測(cè)分析經(jīng)病毒感染和樣品預(yù)處理的細(xì)胞上清中SARS-CoV-2 spike proteins含量。

SARS-CoV-2 spike RBD Nanobody驗(yàn)證數(shù)據(jù)

>>活性驗(yàn)證：SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody與SARS-CoV-2-S1-RBD蛋白結(jié)合

Immobilized SARS-CoV-2-S1-RBD (CSB-YP3324GMY1) at 2 μg/ml can bind SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody, the EC₅₀ is 0.8674 ng/ml.

>>活性驗(yàn)證：SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody和ACE2-HRP偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)性與SARS-CoV-2-S1-RBD結(jié)合

The binding signal of SARS-CoV-2-S1-RBD (CSB-YP3324GMY1) and ACE2-HRP (CSB-MP866317HU) conjugate was gradually reduced as this Nanobody concentrations increased. It indicated that this Nanobody effectively inhibited the SARS-CoV-2-S1-RBD/ACE2 binding. And the IC₅₀ of this Nanobody is 1.296 nM.

>>中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：通過競(jìng)爭(zhēng)性阻止SARS-CoV-2-S1-RBD與ACE2-HRP偶聯(lián)物結(jié)合來(lái)檢測(cè) SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody的中和作用

The inhibition efficacy of the SARS-CoV-2-S1-RBD /ACE2 binding was positively proportionally to this Nanobody concentrations. It showed that this Nanobody effectively inhibited the SARS-CoV-2-S1-RBD/ACE2 binding. And the IC₅₀ of this Nanobody is 0.1074 μg/ml.

>>活性驗(yàn)證：LSPR檢測(cè)SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody與SARS-CoV-2 Spike protein RBD親和力

SARS-CoV-2 Spike protein RBD His/Sumostar Tag (CSB-YP3324GMY1) captured on COOH chip binding to this Nanobody, increases the local refractive index (RI), leading to a red shift of the LSPR peak position. The detected affinity constant of SARS-CoV-2 Spike protein RBD/ this Nanobody binding is 28.2nM.

>>膠體金（GICA）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

In the GICA detection system, the background of this nanobody antibody is clean, the detection limit can be as low as 25ng/ml (1.75ng/0.07ml), and the sensitivity is very good.

>>酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）驗(yàn)證

Immobilize various SARS proteins at concentration of 2μg/ml on solid substrate, then react with the nanobody at concentration of 100μg/ml, 10μg/ml and 1μg/ml. It shows this nanobody is specific for SARS-CoV-2-S1-RBD protein, without any cross-reactivity with MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43 or HCoV-229E.

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