如何判斷ELISA檢測(cè)結(jié)果是否有效，是否存在假陽性或假陰性的情況，原因是什么？
日期：2025-09-26 14:15:38
在ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）檢測(cè)中，判斷結(jié)果有效性的核心是對(duì)照體系的合理性與信號(hào)值的邏輯一致性，而假陽性、假陰性的產(chǎn)生則與試劑質(zhì)量、操作流程、樣本特性等多維度因素相關(guān)。需通過“結(jié)果有效性判斷標(biāo)準(zhǔn)”“假陽性/假陰性的識(shí)別與成因”兩方面系統(tǒng)分析：
一、ELISA檢測(cè)結(jié)果有效性的判斷標(biāo)準(zhǔn)
ELISA結(jié)果是否有效，首要依賴內(nèi)置對(duì)照的正常表現(xiàn)（所有對(duì)照需同時(shí)滿足預(yù)期，缺一不可），其次結(jié)合檢測(cè)樣本的信號(hào)值邏輯（如是否符合濃度梯度規(guī)律），具體判斷依據(jù)如下：
1.核心對(duì)照體系必須全部達(dá)標(biāo)
ELISA實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，對(duì)照的作用是驗(yàn)證“試劑活性”“操作流程”“反應(yīng)環(huán)境”是否正常，所有對(duì)照需同時(shí)滿足預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)，否則結(jié)果無效，常見對(duì)照及達(dá)標(biāo)要求如下：
空白對(duì)照（BlankControl）：僅加酶標(biāo)試劑、底物溶液，不加任何樣本和抗體（或僅加稀釋液），用于檢測(cè)“試劑本底信號(hào)”（如酶標(biāo)二抗的非特異性結(jié)合、底物自發(fā)顯色）。
達(dá)標(biāo)要求：空白對(duì)照的OD值（吸光度值）需≤說明書規(guī)定的上限（通常≤0.1或0.05，具體以試劑說明書為準(zhǔn)）。若空白OD值過高，說明試劑存在污染（如酶標(biāo)二抗變質(zhì)）或操作中引入雜質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致所有樣本信號(hào)偏高，結(jié)果不可靠。
陰性對(duì)照（NegativeControl，NC）：已知不含目標(biāo)抗原/抗體的樣本（如健康人血清、陰性標(biāo)準(zhǔn)品），用于驗(yàn)證“非特異性結(jié)合的基線”。
達(dá)標(biāo)要求：陰性對(duì)照的OD值需≤“cut-off值”（判斷陽性/陰性的臨界值，通常由試劑說明書給出，如陰性對(duì)照OD值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差，或固定值），且需顯著低于陽性對(duì)照。若陰性對(duì)照OD值接近或超過cut-off值，說明存在非特異性結(jié)合干擾，可能導(dǎo)致假陽性。
陽性對(duì)照（PositiveControl，PC）：已知含目標(biāo)抗原/抗體的標(biāo)準(zhǔn)品（濃度明確），用于驗(yàn)證“試劑的檢測(cè)活性”（如包被抗體的結(jié)合能力、酶標(biāo)試劑的催化活性）。
達(dá)標(biāo)要求：陽性對(duì)照的OD值需≥說明書規(guī)定的下限（通常≥0.8或1.0，且需遠(yuǎn)高于cut-off值），且需符合“濃度-信號(hào)正相關(guān)”（如梯度稀釋的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，OD值隨濃度降低而遞減）。若陽性對(duì)照OD值過低（接近c(diǎn)ut-off值）或無信號(hào)，說明試劑失效（如包被抗體變性、酶標(biāo)二抗失活）或反應(yīng)條件異常（如孵育溫度不足、底物過期），所有樣本結(jié)果均無效。
標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照（StandardControl，僅定量ELISA需關(guān)注）：一系列已知濃度的目標(biāo)抗原/抗體（如0、10、50、200pg/mL），用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
達(dá)標(biāo)要求：標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R²）需≥0.98（線性回歸）或0.99（四參數(shù)回歸），且每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值需在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)（如最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值≥1.5，最低濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值需高于空白對(duì)照3倍以上）。若標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差（R²<0.98），說明標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不準(zhǔn)確或反應(yīng)重復(fù)性差，無法準(zhǔn)確定量樣本濃度。
2.樣本信號(hào)值需符合邏輯規(guī)律
在對(duì)照達(dá)標(biāo)的前提下，樣本結(jié)果需滿足“信號(hào)值與檢測(cè)目的一致”：
定性ELISA：樣本OD值＞cut-off值判定為陽性，＜cut-off值判定為陰性，接近c(diǎn)ut-off值（如cut-off值±10%）需重復(fù)檢測(cè)確認(rèn)；
定量ELISA：樣本OD值需落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的“線性范圍內(nèi)”（不可超出最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度或低于最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度），超出范圍需稀釋樣本后重新檢測(cè)（超出上限會(huì)導(dǎo)致信號(hào)飽和，結(jié)果偏低；低于下限則定量不準(zhǔn)確）。
二、ELISA假陽性的識(shí)別與成因
假陽性指“實(shí)際不含目標(biāo)抗原/抗體的樣本，檢測(cè)結(jié)果判定為陽性”，可通過“陰性對(duì)照異常”或“重復(fù)檢測(cè)結(jié)果不一致”識(shí)別，核心成因包括以下4類：
1.非特異性結(jié)合導(dǎo)致的干擾
這是最常見的假陽性原因，指檢測(cè)體系中無關(guān)分子與抗體（包被抗體或酶標(biāo)二抗）發(fā)生非特異性結(jié)合，產(chǎn)生虛假信號(hào)：
樣本自身的干擾物質(zhì)：如血清樣本中的異嗜性抗體（人體天然存在的、可結(jié)合動(dòng)物IgG的抗體，如類風(fēng)濕因子）、高濃度的蛋白質(zhì)（如白蛋白、免疫球蛋白）或脂質(zhì)，會(huì)與酶標(biāo)二抗（通常為鼠源、兔源IgG）結(jié)合，導(dǎo)致OD值升高；
抗體交叉反應(yīng)：包被抗體或酶標(biāo)二抗的特異性不足，與樣本中結(jié)構(gòu)類似的“同源分子”結(jié)合（如檢測(cè)流感病毒A的抗體，與流感病毒B的某一抗原表位交叉結(jié)合）；
試劑污染：酶標(biāo)二抗中混入了與樣本無關(guān)的抗體，或底物溶液被酶（如辣根過氧化物酶HRP）污染，導(dǎo)致非特異性顯色。
2.操作流程不規(guī)范
孵育條件異常：如孵育溫度過高（超過37℃）或時(shí)間過長(zhǎng)（如說明書要求30分鐘，實(shí)際孵育60分鐘），會(huì)增加抗體與無關(guān)分子的非特異性結(jié)合；
洗滌不充分：ELISA每一步反應(yīng)后需用洗滌液（如含吐溫20的PBS）沖洗反應(yīng)孔，去除未結(jié)合的抗體/樣本。若洗滌次數(shù)不足、洗滌液用量不夠或未甩干殘留液體，未結(jié)合的酶標(biāo)二抗會(huì)殘留于孔中，導(dǎo)致顯色偏深；
樣本交叉污染：加樣時(shí)槍頭混用、反應(yīng)孔液體溢出，導(dǎo)致陽性樣本的抗原污染陰性樣本，出現(xiàn)假陽性。
3.試劑質(zhì)量問題
包被抗體純度低：包被在酶標(biāo)板上的抗體含雜蛋白，或未封閉的酶標(biāo)板孔壁（未用BSA、酪蛋白封閉）暴露，導(dǎo)致樣本中無關(guān)分子吸附在孔壁，產(chǎn)生背景信號(hào)；
酶標(biāo)二抗活性過高或非特異性強(qiáng)：酶標(biāo)二抗的標(biāo)記效率過高，或未去除針對(duì)樣本中其他成分的抗體，易與無關(guān)分子結(jié)合。
三、ELISA假陰性的識(shí)別與成因
假陰性指“實(shí)際含目標(biāo)抗原/抗體的樣本，檢測(cè)結(jié)果判定為陰性”，可通過“陽性對(duì)照正常但樣本無信號(hào)”或“已知陽性樣本檢測(cè)為陰性”識(shí)別，核心成因包括以下4類：
1.樣本處理不當(dāng)導(dǎo)致目標(biāo)分子失活或損失
樣本采集/儲(chǔ)存錯(cuò)誤：如檢測(cè)血清中的抗原，卻使用了溶血樣本（紅細(xì)胞破裂釋放的血紅蛋白會(huì)抑制酶活性，導(dǎo)致顯色減弱）；樣本長(zhǎng)期室溫放置（目標(biāo)抗原降解，如RNA病毒、不穩(wěn)定蛋白）或反復(fù)凍融（抗原變性）；
樣本稀釋錯(cuò)誤：樣本濃度過高卻未稀釋，導(dǎo)致“鉤狀效應(yīng)”（高濃度抗原與包被抗體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合，形成“抗原-抗體”復(fù)合物，無法再結(jié)合酶標(biāo)二抗，反而使信號(hào)值降低，甚至低于cut-off值）；或稀釋倍數(shù)過高，導(dǎo)致抗原濃度低于檢測(cè)下限；
提取過程失誤：如從組織、細(xì)胞中提取抗原時(shí)，使用的裂解液過于劇烈（如高濃度變性劑），導(dǎo)致抗原變性，無法與抗體結(jié)合。
2.試劑失效或反應(yīng)條件不足
關(guān)鍵試劑過期：如包被抗體變性（失去結(jié)合抗原的能力）、酶標(biāo)二抗的酶活性喪失（如HRP失活）、底物溶液過期（如TMB底物氧化失效，無法顯色）；
反應(yīng)條件不足：如孵育溫度過低（如低于25℃）或時(shí)間過短（如說明書要求60分鐘，實(shí)際僅孵育15分鐘），導(dǎo)致抗體與抗原的結(jié)合不充分；底物反應(yīng)時(shí)間不足（如說明書要求15分鐘，實(shí)際僅5分鐘），顯色未達(dá)到檢測(cè)閾值。
3.抗體特異性過強(qiáng)或表位遮蔽
抗體識(shí)別的表位被修飾：如檢測(cè)的抗原在樣本中存在翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化），而包被抗體識(shí)別的是“未修飾表位”，導(dǎo)致無法結(jié)合；
樣本中存在“封閉因子”：如樣本中的游離抗原片段、藥物分子（如針對(duì)目標(biāo)抗原的治療抗體），會(huì)先與樣本中的目標(biāo)抗原結(jié)合，遮蔽抗體識(shí)別的表位，導(dǎo)致抗體無法結(jié)合抗原。
四、減少假陽性/假陰性的關(guān)鍵措施
嚴(yán)格遵循試劑說明書：包括樣本處理方法、孵育溫度/時(shí)間、洗滌次數(shù)、試劑稀釋比例，不隨意調(diào)整操作步驟；
設(shè)置足夠的對(duì)照：除基礎(chǔ)的空白、陰/陽性對(duì)照外，可增設(shè)“樣本對(duì)照”（樣本+稀釋液，無抗體）排除樣本自身顯色干擾；
重復(fù)驗(yàn)證可疑結(jié)果：對(duì)接近c(diǎn)ut-off值的樣本、與臨床診斷不符的結(jié)果，需用同一試劑重復(fù)檢測(cè)，或換用不同廠家的試劑交叉驗(yàn)證；
優(yōu)化樣本處理：如血清樣本離心去除脂質(zhì)、溶血成分；高濃度樣本按梯度稀釋，避免鉤狀效應(yīng)；使用無酶污染的耗材處理樣本。
異性結(jié)合不足”或“目標(biāo)分子無法有效結(jié)合”，需從試劑質(zhì)量、操作規(guī)范、樣本特性三方面綜合控制，才能確保檢測(cè)結(jié)果可靠。
