高分辨率熔解（High-resolution melting，簡稱HRM）分析是一門新興的技術(shù)。它僅僅通過PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測PCR片段的微小序列差異，從而應(yīng)用在突變掃描、序列配對和基因分型等多個(gè)方面。憑借其速度和簡便性，高分辨率熔解這種方法正在迅速普及。

        其實(shí)雙鏈DNA的熔解分析可追溯到上世紀(jì)六十年代，當(dāng)時(shí)是通過紫外吸收來監(jiān)測的。分析需要幾微克的DNA，而樣品以0.1-1.0°C/分鐘的速率緩慢加熱，常常要花上幾個(gè)小時(shí)才能完成。后來，LightCycler定量PCR儀的出現(xiàn)，讓熒光熔解分析變得流行。樣品量因毛細(xì)管而縮減至納克級，且熔解速率更快，達(dá)0.1-1.0°C/秒，這樣熔解時(shí)間縮短至幾分鐘。當(dāng)時(shí)使用的染料是SYBR® Green I。

       然而，這種熔解分析只能區(qū)分在片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列，比如檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在引物二聚體及其他非特異性的擴(kuò)增。如果要區(qū)分SNP，分辨率還不夠。為什么呢？這里有必要先介紹一下飽和染料和非飽和染料。SYBR Green I就屬于非飽和性染料，由于它對PCR的抑制作用，在實(shí)驗(yàn)中的使用濃度很低，遠(yuǎn)未將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫變性時(shí)，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生重排，熒光染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點(diǎn)，造成熒光信號沒有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降。

        于是，飽和染料問世了。為什么稱為飽和染料呢？因?yàn)樗鼈兗幢阍陲柡蜐舛龋晒庾畲螅┫?，也不會抑制PCR。故高濃度的染料飽和了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA解鏈過程中就不會發(fā)生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。目前市場上的飽和染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等幾種。光有染料還不夠，儀器也要相應(yīng)升級呢。

        擴(kuò)增子的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個(gè)堿基發(fā)生了突變，都會改變DNA鏈的解鏈溫度。但是這個(gè)差異極小，只有零點(diǎn)幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無法檢測的。
 

        那么什么樣的分辨率才是高分辨率呢？根據(jù)儀器現(xiàn)有的功能測試，在熔解操作時(shí)每攝氏度至少要獲得10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，這是對儀器的最低要求。此外，溫度均一性也同樣重要。如果兩孔之間溫度相差0.1°C，就很可能導(dǎo)致最終的熔解溫度相差0.1°C，這樣就無法保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。大多數(shù)常規(guī)定量PCR儀的孔間溫度差在0.3-0.5°C，這也決定了它們無法勝任HRM。

        目前市場上有多個(gè)廠家提供HRM分析的儀器，包括Idaho Technology、Corbett（QIAGEN）、Roche等，有些是專供HRM的儀器，有些則是附帶HRM功能的定量PCR儀。HRM的發(fā)明者—美國猶他大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Wittwer實(shí)驗(yàn)室曾評估了市場上多臺儀器在基因分型和突變掃描上的性能1。他們發(fā)現(xiàn)，對于大部分儀器的準(zhǔn)確基因分型來說，主要限制在于平板上的空間溫度差異（Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020-0.264°C）。其它差異如數(shù)據(jù)密度、信噪比和熔解速率，也會影響雜合體的掃描。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，空氣加熱型儀器以及樣品溫度單獨(dú)控制的儀器有著更低的Tm標(biāo)準(zhǔn)偏差（0.018-0.065），而加熱塊型儀器則在0.092-0.274。

        在擁有飽和染料和高分辨率儀器之后，HRM分析就可以開始啦。這個(gè)過程其實(shí)很簡單，就是對PCR的擴(kuò)增子進(jìn)行加熱，溫度從50°C逐漸上升到95°C。在此過程中，擴(kuò)增子逐漸解鏈，在到達(dá)熔解溫度（Tm）時(shí)，DNA鏈完全分開。在HRM分析的初期，熒光強(qiáng)度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強(qiáng)度也就下降了。HRM儀器通過照相機(jī)，記錄下熒光變化的整個(gè)過程。通過對數(shù)據(jù)的作圖，就生成了熔解曲線。

        果然夠簡單吧，連探針也無需設(shè)計(jì)，只要在常規(guī)PCR中加一個(gè)飽和染料即可。HRM既可以對未知突變進(jìn)行篩查、掃描，也可以對已知突變進(jìn)行分析。相對于傳統(tǒng)的突變分析而言，操作步驟大大簡化，時(shí)間和成本也降低了不少。而且樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行HRM分析，無需轉(zhuǎn)移，真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作，降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)。

        正是憑借這些優(yōu)勢，HRM近年來廣泛用于突變掃描、序列配對、基因分型和甲基化分析等應(yīng)用中。

序列配對

        序列差異分析常用的方法包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜、測序等，這些方法都需要分離樣品，之后進(jìn)行多步反應(yīng)，操作繁瑣，耗時(shí)長，且PCR產(chǎn)物有污染的風(fēng)險(xiǎn)。而HMR在5分鐘之內(nèi)就能完成，無需額外的步驟，也容易開發(fā)成高通量篩選，且是唯一的閉管操作，增加了分析的可靠性，這些優(yōu)勢對于分子診斷分析而言，格外重要。

       在器官移植中，醫(yī)生通常會檢測兄弟姐妹的HLA，以便了解主要組織相容性是否匹配。利用PCR產(chǎn)物的熔解曲線，能快速配對HLA序列。與熔解溫度（Tm）不同，那只是熔解曲線上的一個(gè)點(diǎn)，高分辨率熔解是分析整個(gè)熔解曲線。利用熔解曲線的形狀作為指示劑，來顯示雜合DNA所形成的異源雙鏈的序列匹配。之后將兩個(gè)DNA按1：1的比例混合，重新熔解，并將新曲線與原先的曲線進(jìn)行比較，來驗(yàn)證序列的匹配。如果兩個(gè)樣品的序列不是完全相同的，那么混合后異源雙鏈的熔解曲線形狀會改變。

       瑞典烏普薩拉大學(xué)的Olof Gidlöf等曾開發(fā)出線粒體基因組中兩個(gè)超變區(qū)HVI和HVII的HRM分析，以分辨不同個(gè)體的DNA，作為法醫(yī)鑒定中測序前的預(yù)篩選2。研究結(jié)果表明，線粒體DNA中HVI和HVII所存在的序列變異確實(shí)產(chǎn)生了熔解曲線形狀的差異，能辨別不同個(gè)體的DNA，這樣就能排除不匹配的法醫(yī)材料，從而節(jié)省線粒體DNA測序的時(shí)間和費(fèi)用。另外，與其它技術(shù)相比，HRM操作簡單，價(jià)格低，能同時(shí)篩選大量的樣本。

突變掃描

        單堿基改變、插入、缺失都能通過HRM來檢測。在靈敏度和特異性方面，高分辨率熔解也高于dHPLC在內(nèi)的傳統(tǒng)方法。當(dāng)變異體為低等位基因片段時(shí)，它甚至比DNA測序還靈敏。測序只能檢測低至20%的變異體，而HRM能檢測的變異體低至2%。而且，測序所花的時(shí)間、費(fèi)用和精力，與HRM是不可同日而語的。

        對于400 bp以下的PCR產(chǎn)物，掃描單堿基變化的靈敏度和特異性皆為100%。對于400到1000 bp的PCR產(chǎn)物，靈敏度為96.1%，特異性為99.4%。PCR產(chǎn)物中變異的位置不影響掃描準(zhǔn)確性。盡管HRM是為檢測雜合體（一個(gè)等位基因發(fā)生突變）而設(shè)計(jì)的，但它也能檢測純合體（兩個(gè)等位基因都有突變）。對于半合子變異體（X連鎖或Y染色體），最好將未知樣品與已知野生型的樣品混合。

        LMNA基因的突變會導(dǎo)致多種失調(diào)，現(xiàn)在稱之為核纖層蛋白綜合征。由于待研究的個(gè)體頗多，故必須用一種特別靈敏且特異的方法來進(jìn)行突變掃描。于是，Gilles Millat等就開發(fā)出適合LMNA突變掃描的HRM分析3。他們同時(shí)用了HRM和dHPLC兩種方法，對64位患有擴(kuò)張性心肌病的病人進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，凡是dHPLC或直接測序能檢測出的基因變異，HRM分析也能輕松鑒定，且速度比dHPLC快2倍，還更為經(jīng)濟(jì)。研究人員認(rèn)為，HRM分析是鑒定LMNA遺傳變異的高靈敏、高通量的廉價(jià)方法。

基因分型

        傳統(tǒng)的基因分型方法不僅耗時(shí)費(fèi)力，還需要購買價(jià)格不菲的探針。相比之下，HRM分析則是優(yōu)勢多多，無需擴(kuò)增和制備，排除了污染的風(fēng)險(xiǎn)；探針的錢也省了；還能檢測未知的變異體，這一點(diǎn)探針可無能為力。有了飽和染料，PCR產(chǎn)物全程被標(biāo)記，因此所有的熔解區(qū)域都能檢測到。對于同一擴(kuò)增子內(nèi)的不同雜合體，通過曲線形狀的差異也能區(qū)分開。HRM大約能分辨93%的雜合體。大部分純合體也能通過熔解來分辨，但不是全部。大約有4%的人單堿基變異體有著相同的Tm，且圖像對稱。在這種情況下，可以將已知的純合體與未知的純合體混合，再進(jìn)行分析。

        Lasse Kristensen等曾為參與甲基代謝的關(guān)鍵基因（MTHFR、MTR和DNMT3b）開發(fā)出HRM分析，對它們進(jìn)行基因分型，并在Rotor-gene 6000等儀器上進(jìn)行檢測4。他們認(rèn)為，與基于TaqMan探針的基因分型相比，HRM分析更經(jīng)濟(jì)。無需使用探針，分析所需的優(yōu)化也更少，成功率更高。與焦磷酸測序、SNP芯片等多種技術(shù)相比，HRM是最佳選擇。

甲基化分析

        HRM分析還為DNA甲基化狀態(tài)的檢測另辟蹊徑。DNA樣品通過亞硫酸氫鹽的處理，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。這樣，原先未甲基化模板所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物比甲基化模板的Tm要低。HRM還能確定特定樣品中甲基化的比例。將不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的熔解曲線與之相比較，從而確定樣品中甲基化的比例。

        異常的甲基化模式往往與癌癥相關(guān)聯(lián)，于是Erci Smith等開發(fā)并驗(yàn)證了快速定量DNA甲基化狀態(tài)的HRM分析5。他們利用數(shù)學(xué)方法來標(biāo)準(zhǔn)化加熱DNA所產(chǎn)生的原始熒光數(shù)據(jù)，從這些數(shù)據(jù)中計(jì)算出熔解開始和結(jié)束的溫度，從而反映模板分子的甲基化水平。之后，他們還用已知甲基化水平的寡核苷酸及DNA進(jìn)行了驗(yàn)證。他們發(fā)現(xiàn)，通過HRM分析這種快速單管的方法來定量甲基化是可靠的，引物容易設(shè)計(jì)，且無需專門的軟件。所獲得的參數(shù)提供了標(biāo)本中甲基化的客觀描述和定量，能用于標(biāo)本之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

        綜上，HRM技術(shù)應(yīng)用廣泛，操作簡單又經(jīng)濟(jì)，結(jié)果精確且可靠，適合任何實(shí)驗(yàn)室使用。市場上有一些專供HRM分析的儀器，不過，那些帶有HRM功能的定量PCR儀則更實(shí)用。QIAGEN的Rotor-Gene Q（Corbett Rotor-Gene 6000）就是全球第一臺將實(shí)時(shí)擴(kuò)增與HRM分析技術(shù)相結(jié)合的實(shí)時(shí)熒光定量分析裝置。Rotor-Gene Q的溫度均一性為0.01°C，溫度分辨率為0.02°C，解決了溫度均一性、精確性和分辨率的問題，實(shí)現(xiàn)了定量擴(kuò)增與HRM的合二為一。