表觀遺傳學和基因組學研究都是近年來十分熱門的研究方向， 隨著基因組學的發展，表觀遺傳學的研究也開啟了一個新的研究領域：表觀基因組學研究。這一研究領域利用新一代測序平臺為基礎，結合經典的表觀遺傳學方法，分析各種表觀遺傳修飾。近期來自中山大學生命科學學院的研究人員，與深圳華大基因合作，利用基因組DNA甲基化檢測黃金方法Bisulfite Sequencing (BS-Seq)，對黃曲霉全基因組DNA甲基化進行了測序，首次證明黃曲霉是一種缺乏DNA甲基化的生物。

   這是在世界上第一次使用黃金標準方法—Bisulfite Sequencing研究曲霉屬真菌全基因組DNA甲基化狀態的報道，也是第三種被證實的缺乏DNA甲基化的生物（前兩種分別是果蠅和面粉甲蟲）。為了更深入的了解這一重要的表觀基因組學研究成果，生物通特聯系了中山大學賀竹梅教授研究組，就讀者感興趣的問題請教了賀竹梅教授和他的研究生林劍青同學。

什么是BS-Seq測序方法？

   這項研究采用了目前公認的基因組DNA甲基化檢測黃金方法――BS-Seq測序方法，對黃曲霉全基因組DNA甲基化進行了測序，并從基因進化和基因組序列差異的角度對黃曲霉缺乏DNA甲基化的機制進行了分析，那么這種測序方法具有哪些優點呢？研究組為何選擇了這種方法呢？

   林劍青同學表示，“Bisulfite處理測序是目前公認的對DNA甲基化狀態進行分析的黃金標準。其原理是，對DNA進行Bisulfite處理之后，DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U），而甲基化的C則保持不變。對處理轉化之后的產物進行高通量測序，并與未經Bisulfite處理的原始基因組序列進行分析比較，從而獲得整個基因組DNA甲基化狀態的信息。

   這是一種覆蓋度、分辨率、可靠性都很高的方法，理論上可以獲得整個基因組上每一個C位點的甲基化信息。在本研究中，我們使用的是基于新一代測序技術Bisulfite處理測序技術路線。相比較，之前基于Sanger測序平臺Bisulfite處理測序方法，需要大量的克隆測序，繁瑣費時并且價格昂貴，因此，這種方法僅僅被用于研究局部區域的DNA甲基化，而不能用于全基因組DNA甲基化研究。其次，使用新一代測序平臺之后，Bisulfite處理測序不再需要像基于Sanger測序平臺Bisulfite處理測序一樣設計大量的擴增引物和進行大量的PCR擴增，而僅需要在打斷的DNA片段兩端連接上測序引物即可上機測序，而該引物同時也作為DNA樣品的擴增引物，其作用就相當于在DNA樣品中加入任意擴增引物，避免繁瑣的擴增引物設計和PCR擴增工作。”

   表觀遺傳學是目前生命科學研究的前沿，不僅僅在真菌，其在動物發育、植物育種、人類健康等方面的研究也得到很多科學家的關注，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNA等多個方面， 賀教授實驗室這幾年重點關注了真菌的DNA甲基化現象。

   經過多年的發展，目前世界上研究DNA甲基化的技術手段已經相對比較成熟，從比較簡單的DNA甲基化敏感內切酶、甲基化敏感特異性PCR擴增、HPLC、2D-TLC，到比較先進的甲基化芯片的應用以及在這項研究中所使用的基于新一代測序技術的Bisulfite處理測序[1,2]。

   林劍青說，“我們在前期的研究中通過DNA甲基化敏感內切酶、甲基化敏感特異性PCR擴增等方法已經發現黃曲霉DNA甲基化水平極端低，在這種情況下，需要使用一種準確度和敏感性比較高的研究方法，在整個基因組的范圍內對每一個C位點的甲基化狀態進行研究，使我們的研究結果更有說服力。因此，基于新一代測序技術的Bisulfite處理測序技術成了我們的選擇。”

黃曲霉毒素合成代謝，黃曲霉生殖與DNA甲基化的關聯

   黃曲霉因其產生強致癌物黃曲霉毒素而引起科學家的重視，黃曲霉毒素合成代謝調控的研究已成為微生物次生代謝調控機制的模型。關于曲霉屬（Aspergillus）真菌的DNA甲基化問題，已經困擾科研工作者多年，從上世紀80年代初開始，科學家對曲霉屬真菌的DNA甲基化及其對真菌生長和代謝的影響進行了各種研究。

   賀教授研究組前期曾采用一種廣泛應用于表觀遺傳學和腫瘤生物學及真菌次生代謝物研究的DNA甲基轉移酶抑制劑5－氮雜胞苷（5-AC）對黃曲霉毒素代謝的影響進行了研究，發現5-AC可以誘導黃曲霉產生絨毛狀性狀，同時可以抑制黃曲霉產生黃曲霉毒素的能力。

   因此研究人員推測黃曲霉毒素的合成代謝與DNA甲基化存在一定的關聯，并由此設想，如果能發現一些與DNA甲基化相關的細胞因子，那么就有可能發現能用于黃曲霉毒素代謝的調控因子，從而使我們對黃曲霉毒素代謝的機理有新的認識并為發展黃曲霉毒素控制技術提供新的思路。

   “但進一步的研究讓我們有點失望，黃曲霉基因組缺乏DNA甲基化，這也使得我們不得不轉變對黃曲霉毒素代謝研究的思路”，賀教授說，“從目前的研究來看，黃曲霉毒素的合成代謝與DNA甲基化調控無關。由于黃曲霉毒素的合成代謝是一個相當復雜的事件，雖然其主要的代謝通路已經明確，但許多細節及代謝基因簇以外的基因的作用、環境的影響及其他表觀遺傳的調控還是一個黑洞。”

   除此之外，在另一方面，長期以來，科學家們都認為黃曲霉是一種不具有有性生殖的生物，直到2009年，黃曲霉被發現是具有有性生殖的[3]。但是，在大部分情況下，黃曲霉還是以無性的方式進行生殖。生物的DNA甲基化在有性生殖過程中起著沉默轉座子以維護基因組穩定的重要作用[4]。現存的單細胞真核生物主要是無性生殖的，因此，缺失通過DNA甲基化沉默轉座子的能力很可能更有利于物種的適當進化。

   賀教授說，“結合我們的研究結果，我們推測，對于黃曲霉這種主要以無性生殖方式繁殖的生物，DNA甲基化的缺失可能更利于物種的進化，在黃曲霉中DNA甲基化可能僅僅存在于其有性生殖的短暫瞬間[2]”。“除了生殖方式，目前尚無證據表明DNA甲基化缺失的狀態與黃曲霉的其他生活習性或者毒性有直接的關系，這也是我們的一個意外，還需要更多的研究。”

真菌DNA甲基化研究未來發展

   真菌表觀遺傳學吸引了不少科學家們的關注，當談到這一領域未來的發展的時候，賀教授表示，“在基礎研究方面，與動植物相比，真菌這一生物群體的DNA甲基化水平和甲基化分布尤其特殊，因此，DNA甲基化或其他表觀遺傳變異在真菌次生代謝、環境適應以及真菌進化中所扮演的角色，將成為未來真菌表觀遺傳學研究的趨勢。

   在應用方面，如何通過DNA甲基化或其他表觀遺傳方面的改造，使真菌產生更多的能為人類所利用的代謝物同時抑制有害代謝物的產生，將成為科學家們關注的熱點。雖然黃曲霉毒素代謝中存在DNA甲基化調控的可能性不大，但其他表觀遺傳變異如組蛋白修飾、小分子RNA作用等的調控作用是值得深入研究的。”

下一步計劃

   我們目前的研究已經發現黃曲霉是一種缺乏DNA甲基化的物種，因此，DNA甲基化與黃曲霉毒素合成代謝存在直接聯系的可能性比較小。然而，確實有一些證據表明黃曲霉在表觀遺傳層面對黃曲霉毒素生物合成過程具有調控作用。

   因此賀教授下一步將通過各種技術手段，進一步探究各種表觀遺傳現象如組蛋白修飾、microRNA等在黃曲霉毒素代謝中所扮演的角色。

   賀教授說，“我們實驗室在上一個國家基金的資助下對黃曲霉毒素代謝與胞內氧化應激的關聯進行了研究，也發現了一些有趣的現象，我們也將會在基因組層面如利用轉錄組學方法等繼續對黃曲霉毒素代謝調控的機制作進一步的探索。”