使用ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統分析抗體-膜結合蛋白以及蛋白-脂類物質間的相互作用
日期：2011-04-08 08:13:02
介紹：
研究細胞膜、膜結合蛋白和抗體間的相互作用以及這些作用的互相影響是藥物研發中非常值得關注的事情。膜蛋白和膜相關蛋白以及多肽類物質在很多生物過程中的地位都非常重要，同時還參與到一些諸如癌癥等疾病的關鍵信號通路中。因此，膜蛋白正迅速成為下一代藥物靶點分子大類。
ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統基于表面等離子體共振（SPR）技術，可同步測定36種生物分子間的相互作用。本文就是利用其研究人工膜和兩種重要的多肽。Amyloid beta （A）肽在阿爾茨海默病的病理改變中起重要作用，而-synuclein肽則存在于帕金森病的病理變化中。通過一張修飾過的ProteOn傳感芯片，我們將Ab與人工膜的結合動力學數據給測定出來。我們還描述了如何使用ProteOn NLC芯片來捕獲生物素標記的和非生物素標記的膜蛋白脂質體，并展示了嵌入脂膜中的蛋白和各自抗體的，呈明顯劑量-效應關系的相互作用曲線。點擊索取更多技術資料
圖1. ProteOn XPR36 系統配基-分析物結合分析的6 × 6陣列格式。A) 6個ligand 被偶聯到6條平行的縱向通道中（藍色）；B) 6個analyte注入到6條與之前相垂直的通道中（黃色）；C) 單個ligand–analyte互作位點 (綠色區域)以及2個位點間參照（黃色）。
實驗1. 使用單層小泡（SUVs）對GLM芯片進行修飾并捕獲A和-Synuclein多肽
芯片修飾
傳感芯片表面用50 mM NaOH和8 mM CHAPS分別在橫向和縱向兩個方向沖洗兩遍，然后縱向連續注入3針PBS，流速設為100 µl/min。通道1、3和5用0.05 M sulfo-NHS和0.02 M EDAC活化，條件為30 µl/min，6分鐘。將5 µl Undecylamine（十一胺）和495 l DMSO（二甲基亞砜）混合后用pH 5.0的醋酸鈉溶液稀釋20倍。混合液用移液器吹打混勻，直至澄清。Undecylamine (0.05% v/v) 以30µl/min，注入到通道1、3和5，持續6分鐘。最后將通道1、3和5用1M 鹽酸乙醇胺去活化，條件是30 µl/min，6分鐘。隨后芯片表面用50 mM NaOH縱向流過芯片以穩定基線。
脂質捕獲
單層小泡（SUV）的制備是參照前人文獻 (Smith et al., 2008)，然后用PBS稀釋到終濃度0.4 mM。SUV在30 µl/min的流速下縱向注入芯片400s。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [phospho-L-choline] (POPC) (0.4 mg/ml)注入通道1和2。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero- 3-[phospho-L-serine] (POPS)注入通道3和4。通道5和6流過POPC和POPS的混合物。
Analyte注入
A 蛋白(100 µg)按照已有文獻的描述的制備成終濃度22 µM的PBS溶液。芯片表面用PBS以100 µl/min橫向注入30秒沖洗。沖洗3-4次后A (8.8 µM)或-synuclein (7 µM)以100 µl/min橫向注入，結合1分鐘，解離10分鐘。測定動力學數據時，A蛋白以一系列濃度 (11 µM, 5.5 µM, 2.75 µM, and 1.375 µM) 注入4個通道，僅留一個通道注入緩沖液。
芯片表面再生
芯片再生需要去掉脂質，用50 mM NaOH和8mM CHAPS依次注入芯片，采用短時脈沖形式，即100 µl/min的流速，18秒。
圖2. 將特定的脂質 POPC, POPS, 和 POPC/POPS 捕獲在Undecylamine處理過的GLM 傳感芯片表面。
圖3. A 蛋白有選擇性地結合到用Undecylamine 處理過，并偶聯了脂質POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中；A 蛋白不會被捕獲到未經處理的芯片表面。
圖4. -synuclein蛋白有選擇性地結合到用Undecylamine 處理過，并偶聯了脂質POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中；-synuclein不會被捕獲到未經處理的芯片表面。
圖5. A蛋白和OPC/POPS處理過的表面的濃度依賴性結合曲線。動力學數據來自3次結合實驗的平均值：ka = 8.5 (± 0.3 ) x 103 M-1s-1; kd = 3.3 (± 0.1) x 10-3 s-1; KD = 407 (± 9) nM。
圖6. 芯片再生后，將脂質POPC, POPS, 和POPC/POPS再次捕到undecylamine處理過的GLM 傳感芯片上。通道1，3和5的再生用50 mM NaOH和8mM CHAPS依次注入。實線代表第一次脂質捕獲曲線，虛線表示第二次捕獲。點線代表脂質注入到未處理過的芯片通道2，4和6。
實驗2. 生物素修飾的脂質體捕獲到NLC芯片表面
脂質結合
將含單純皰疹病毒標簽的M2肽的低生物素化二肉豆蔻酰磷脂酰（DMPC）膽堿脂質體（以色列Weizmann 研究所Shai Arkin 教授惠贈）用緩沖液（PBS）稀釋2倍，然后以25 l/min流速注入垂直方向的1通道，注入2次，共60 l。作為對照，將不含HSV-M2肽的生物素化的脂質體和非生物素化的脂質體分別注入水平方向的2和3通道。
Analyte注入
將120l 333nM的抗HSV抗體以100l /min流速注入水平通道。
再生
以100l /min流速注入20mM CHAPS，注入1.2分鐘去除脂質體和抗體。后續分析實驗可重新偶聯脂質體和抗體。
圖7. 生物素化脂質體捕獲到NLC芯片表面。通道1（藍色曲線），整合HSV-M2肽的生物素化脂質體；通道2（粉色曲線），不含HSV-M2肽的非生物素化脂質體（無結合）；通道3（淺藍色曲線），不含HSV-M2肽的生物素化脂質體（無結合）。
圖8 捕獲到NLC芯片表面的含HSV-M2肽的生物素化脂質體與抗HSV抗體的相互作用。左圖，通道中抗HSV抗體與脂質體結合的原始圖線。通道1（藍色曲線），整合HSV-M2肽的生物素化脂質體；通道2（粉色曲線），不含HSV-M2肽的非生物素化脂質體（無結合）；通道3（淺藍色曲線），不含HSV-M2肽的生物素化脂質體（無結合）。右圖，抗HSV抗體與整合HSV-M2肽的生物素化脂質體的特異性反應（以通道2為參照通道）。
圖9. 脂質體再生和重新捕獲。
實驗3. 在修飾過的NLC芯片表面捕獲非生物素化的脂質體
脂質的結合
為了避免使用囊泡，將生物素化的雙棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)加入到含有10% DMSO的運行緩沖液中，在垂直方向上以25 l/min的流速注射180 l到通道1和通道2，將含有HSV-M2多肽的非生物素化的脂質體以25 l/min的流速注射100 l到通道1，通道2作為空白參照。
Analyte的注入
抗HSV的抗體分別以10, 5, 和2.5 nM三個濃度，100 μl/min的流速，水平注射250μl。
再生
將20 mM Tween 20或20 mM CHAPS以25 μl/min的流速注射30 μl可以除去脂質體和抗體。再生后，按照上述方法重復注射過程，可將脂質體重新捕獲到NLC芯片表面。
圖10. 抗HSV的抗體(10, 5, 和2.5 nM)與嵌入到NLC芯片表面脂質體中的HSV-M2多肽的相互作用。
結論
• ProteOn XPR36蛋白相互作用系統提供了操作簡便、低成本的方法，便于研究膜-蛋白之間和膜蛋白-抗體之間的相互作用。
• 這些相互作用能通過ProteOn 系統的6*6陣列采用高通量的方式進行測定。
• 源于 POPC 和 POPS 的單層小泡（SUV）能夠被反復地捕獲到修飾過的ProteOn GLC芯片上，Aβ 多肽和 α-synuclein 多肽的結合程度亦能測定。
• 能測定Aβ 多肽與芯片上捕獲的POPC/POPS SUV 表面的結合動力學。
• 含有HSV標簽的 M2 多肽的脂質體，不管是生物素化與否，都可以反復結合到ProteOn NLC芯片上，重復性很好。
• 抗HSV標簽的抗體和嵌入到脂質體中的M2多肽的相互作用也能被檢測到。
• ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統是個強大的工具，可以用于研究膜和膜相關蛋白、多肽、抗體的相互作用。
參考文獻
Smith DP et al. (2008). Formation of a high affinity lipid-binding intermediate during the early aggregation phase of alpha-synuclein. Biochemistry 47 (5), 1425–1434.
Tew DJ et al. (2008). Stabilization of neurotoxic soluble beta-sheet-rich conformations of the Alzheimer’s disease amyloid-beta peptide. Biophys J 94 (7), 2752–2766.
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