雙雜交系統的建立得力于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。80 年代的工作表明，轉錄激活因子在結構上是組件式的（modula r），即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成，其中有DNA 結合結構域（DNA binding domain，簡稱為DB）和轉錄激活結構域（activation domain，簡稱為AD），它們是轉錄激活因子發揮功能所必需的。單獨的DB 雖然能和啟動子結合，但是不能激活轉錄。而不同轉錄激活因子的DB 和AD 形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能。如酵母細胞的Gal4 蛋白的DB 與大腸桿菌的一個酸性激活結構域B42 融合得到的雜合蛋白仍然可結合到Gal4 結合位點并激活轉錄。Fields 等人的工作標志雙雜交系統的正式建立。他們以與調控SUC2 基因有關的兩個蛋白質Snf1 和Snf2 為模型，將前者與Gal4 的DB 結構域融合，另外一個與Gal4 的AD 結構域的酸性區域融合。由DB 和AD 形成的融合蛋白現在一般分別稱之為“ 誘餌” （bait）和“ 獵物” 或靶蛋白（prey or target protein）。如果在Snf1 和Snf2 之間存在相互作用，那么分別位于這兩個融合蛋白上的DB 和AD 就能重新形成有活性的轉錄激活因子，從而激活相應基因的轉錄與表達。這個被激活的、能顯示“ 誘餌” 和“ 獵物” 相互作用的基因稱之為報道基因（reporter gene）。通過對報道基因表達產物的檢測，反過來可判別作為“ 誘餌” 和“ 獵物” 的兩個蛋白質之間是否存在相互作用。在此Fields 等人采用編碼β - 半乳糖苷酶的LacZ 作為報道基因，并且在該基因的上游調控區引入受Gal4 蛋白調控的GAL1 序列。這個改造過的LacZ 基因被整合到酵母染色體URA3 位上。而酵母的GAL4 基因和GAL80 基因（Gal80 是Gal4 的負調控因子）被缺失，從而排除了細胞內源調控因子的影響。已經知道在Snf1 和Snf2 之間存在相互作用。結果發現只有同時轉化了Snf1 和Snf2 融合表達載體的酵母細胞才有β - 半乳糖苷酶活性，單獨轉化其中任何一個載體都不能檢測出β - 半乳糖苷酶活性。

目前發展起來的各種雙雜交系統大多是以Fields 等人建立的系統為基礎的。這些新系統主要對報道基因、“ 誘餌” 表達載體以及“ 獵物” 表達載體等做了一些改進。其中一個重要改進是引入額外的報道基因，如廣泛采用的HIS3 基因。經過改造帶有HIS3 報道基因的酵母細胞，只有當HIS3 被啟動表達才能在缺乏組氨酸的選擇性培養基上生長。HIS3 報道基因的轉錄表達是由“ 誘餌” 和“ 獵物” 的相互作用所啟動的。大多數雙雜交系統往往同時使用兩個甚至三個報道基因，其中之一是LacZ 。這些改造后的基因在啟動子區有相同的轉錄激活因子結合位點，因此可以被相同的轉錄激活因子（如上述的Gal4 蛋白）激活。通過這種雙重或多重選擇既提高了檢測靈敏度又減少了假陽性現象。其他還有針對“ 誘餌” 或“ 獵物” 表達載體等所作的改進。

在雙雜交鑒定過程中要經過兩次轉化，這個工作量是相當大的，特別是尋找新的作用蛋白質的時候尤其如此。而且，酵母細胞的轉化效率比細菌要低約4 個數量級。因此轉化步驟就成為雙雜交技術的瓶頸。Bendixen 等人通過酵母接合型的引用，避免了兩次轉化操作，同時又提高了雙雜交的效率。在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型： a 接合型和α 接合型，這兩種單倍體之間接合（mating）能形成二倍體，但a 接合型細胞之間或α 接合型細胞之間不能接合形成二倍體。根據酵母有性生殖的這一特點，他們將文庫質粒轉化α 接合型酵母細胞，“誘餌”表達載體轉化a 接合型細胞。然后分別鋪篩選平板使細胞長成菌苔（lawn），再將兩種菌苔復印到同一個三重篩選平板上，原則上只有誘餌和靶蛋白發生了相互作用的二倍體細胞才能在此平板上生長。單倍體細胞或雖然是二倍體細胞但DB 融合蛋白和AD 融合蛋白不相互作用的都被淘汰。長出來的克隆進一步通過β - 半乳糖苷酶活力進行鑒定。這項改進不僅簡化了實驗操作，而且也提高了雙雜交的篩選效率。

在研究蛋白質的結構功能特點、作用方式過程中，有時還要通過突變、加抑制劑等手段破壞蛋白質間的相互作用。針對實際工作中的這種需要，Vidal 等人發展了所謂的逆雙雜交系統（reverse two-hybrid system）。這項技術的關鍵是報道基因URA3 的引入。URA3 基因在這里起到了反選擇的作用，它編碼的酶是尿嘧啶合成的關鍵酶。該酶能把5- 氟乳清酸（5-FOA）轉化成對細胞有毒的物質。Vidal 等人通過改造在URA3 基因的啟動子內引入Gal4 的結合位點。這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養基上只有當“ 誘餌” 和“ 獵物” 相互作用激活URA3 基因的表達才能生長。在含有5-FOA 的完全培養基上“ 誘餌” 和“ 獵物” 的相互作用則抑制細胞的生長。然而如果目的蛋白，即與DB 或AD 融合的蛋白質發生了突變或者由于外加藥物的干擾不再相互作用，URA3 基因不表達，則細胞能在含有5-FOA 的完全培養基上生長。通過這種方法，Vidal 等人篩選到了轉錄因子E2F1 的突變物，這些突變物仍然能結合視網膜母細胞瘤蛋白RB，但是喪失了同另外一種稱為DP1 蛋白的結合能力。結果得到了體外結合實驗的驗證。通過對這些突變蛋白基因的測序，他們發現了新的E2F1 同DP1 結合的位點。

以上介紹的酵母雙雜交系統都是建立在對RNA 聚合酶II 的激活的基礎上的。