定點(diǎn)突變是序列-功能研究中不可或缺的工具。然而，傳統(tǒng)的方法能力有限。華盛頓大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)出一種新方法，能夠以大規(guī)模并行的方式開(kāi)展單個(gè)氨基酸的定點(diǎn)突變。這項(xiàng)成果于1月5日發(fā)表在《Nature Methods》雜志上。

目前的定點(diǎn)突變方法能力有限，每次只能靶定幾個(gè)堿基，且操作繁瑣，成本高昂。為了克服這些限制，華盛頓大學(xué)Jay Shendure領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種名為PALS（programmed allelic series）的方法，將基于芯片的DNA合成與重疊延伸突變相結(jié)合，以大規(guī)模并行的方式在每個(gè)cDNA模板引入單個(gè)突變。

首先，研究人員在芯片上合成突變引物，每條引物的中心附近有一個(gè)突變。這些引物的兩側(cè)帶有接頭，這樣可利用PCR去除。隨后將引物與野生型的正義鏈退火并延伸，并降解底物，擴(kuò)增突變體。在接頭被剪掉后，大引物沿著野生型目的基因的反義鏈延伸。隨后降解底物，產(chǎn)生全長(zhǎng)的單突變拷貝，并通過(guò)PCR擴(kuò)增。

為了獲得全長(zhǎng)序列，Shedure及其同事克隆突變的文庫(kù)，在每個(gè)克隆上添加一個(gè)隨機(jī)條形碼，并開(kāi)展分層標(biāo)簽指導(dǎo)的測(cè)序，獲得一組一致單體型及相關(guān)標(biāo)簽。

作為概念證明，研究人員以酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）為模板，構(gòu)建PALS文庫(kù)。他們針對(duì)結(jié)構(gòu)域中的每個(gè)密碼子，將其替換成編碼其他氨基酸的密碼子或提前終止密碼子。研究人員發(fā)現(xiàn)，~47%的全長(zhǎng)單體型有且只有一個(gè)編程的突變。在這些“干凈”的克隆中，99.9%的單密碼子替換至少觀察到一次，而99.7%至少觀察到五次。

研究人員隨后轉(zhuǎn)到p53，看看他們的方法是否能擴(kuò)展到靶定全長(zhǎng)cDNA。與Gal4實(shí)驗(yàn)不同，他們這一次通過(guò)簡(jiǎn)并密碼子來(lái)替換p53的密碼子。結(jié)果，他們報(bào)告了較低的單突變單體型（33%），研究人員認(rèn)為這可能是由于較長(zhǎng)模板的二次錯(cuò)誤概率增加。不過(guò)，研究人員仍然在干凈的單突變克隆中觀察到93.4%的氨基酸替換。

Shendure及其同事指出，總的來(lái)說(shuō)，PALS的突變覆蓋度基本上是均一的，不過(guò)略為偏向N端，這在Gal4和p53研究中都觀察到。

研究人員還利用PALS開(kāi)展了Gal4的深度突變掃描。他們將Gal4 DBD文庫(kù)引入雙雜交的報(bào)告系統(tǒng)。其中，Gal4基因被去除，替換為HIS3基因，它處于GAL1啟動(dòng)子的控制之下。如果Gal4 DBD突變體能夠與DNA結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，那么HIS3表達(dá)，則系統(tǒng)能夠在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，在選擇但不是許可的條件下，提前終止密碼子是有害的，大約三分之一的殘基無(wú)法忍受突變。

Shendure及其同事表示：“PALS突變、功能選擇和深度測(cè)序的組合為解析人類基因的等位基因異質(zhì)性提供了一個(gè)通用框架，也有助于對(duì)越來(lái)越多的意義不明的變異進(jìn)行功能注釋。”